Biotechnologia roślin 01-BT-RO-S2-2BT-12
Laboratorium (L) semestr zimowy 2015/2016

Malepszy S. (red). 2011. Biotechnologia Roślin. PWN, Warszawa

Biotechnologia – kwartalnik

Serwis informacyjny: http://www.biotechnolog.pl

Szarejko and R. J. Jones (eds.). Manual on General Genetics and Basic Method in Plant Biotechnology. Wydawnictwa Uniwersytetu Śląskiego, Katowice, pp. 105-141.

The Arabidopsis Book, wydawnictwo on-line American Society of Plant Biologists: http://my.aspb.org/members/group.asp?id=68456 Hejnowicz Z. Anatomia i Histogeneza Roślin Naczyniowych. Organy wegetatywne. 2002. PWN, Warszawa

1. Ocena ciągła umiejętności praktycznych i przygotowania merytorycznego do laboratoriów:

- przestrzeganie zasad pracy w specjalistycznym laboratorium

- umiejętność przeprowadzenia eksperymentu oraz obserwacji i wyciągania wniosków

- znajomość podstaw merytorycznych realizowanego tematu laboratorium

Ocena w skali 0 – 3 , gdzie maksymalna liczba punktów potwierdza bardzo dobrą znajomość metod i materiałów zastosowanych w eksperymencie oraz umiejętność przeprowadzania eksperymentu i wyciągania prawidłowych wniosków Do uzyskania pozytywnej oceny ciągłej umiejętności praktycznych niezbędne jest otrzymanie ponad 50% maksymalnej liczby punktów (tj. 3 x liczba zrealizowanych tematów). Ocena jest przeprowadzana dla każdego z realizowanych tematów. Każdy temat laboratorium kończy test - student odpowiada pisemnie na 2 pytania kontrolne (tzw. „wyjściówka”); każde pytanie oceniane w skali 0-2 punktów . Negatywnie oceniona aktywność studenta skutkuje brakiem zaliczenia

2. Przygotowanie raportu z pracy laboratoryjnej:

Każdy student przygotowuje 3 raporty z zajęć laboratoryjnych – sprawozdania dotyczą jednego z tematów realizowanych w ramach danej Katedry prowadzącej przedmiot (KG, KAiCR oraz KBiMR). Raporty przygotowywane są w 2-osobowych zespołach i zawierają cel doświadczenia, opis metody, analizę i prezentację wyników zakończoną wnioskami dotyczącymi realizacji wybranego tematu zajęć laboratoryjnych.

Każdy raport oceniany jest w skali punktowej 0 – 5 (co 0,5), gdzie za brak sprawozdania jest 0 punktów, za sprawozdanie bez błędów merytorycznych 5 punktów. Raporty przygotowywane są parami – student podaje swój udział w przygotowaniu sprawozdania, określając zakres swojej pracy.

Maksymalna liczba punktów za raporty: 3x 5 = 15. Dla uzyskanie zaliczenia z tej części aktywności wymagana liczba punktów >7,5.

Raporty składane są w formie pisemnej w terminie tygodnia od zakończenia bloku tematycznego w danej Katerze. Za opóźnienie odejmuje się 0,5 punktu od oceny sprawozdania.

Negatywnie oceniony raport skutkuje brakiem zaliczenia.

3. Kolokwium zaliczeniowe:

Na kolokwium obowiązują treści objęte zajęciami laboratoryjnymi uzupełnione o wiadomości uzyskane przez studenta podczas pracy własnej z zaleconą literaturą obowiązkową.

Każde z pytań oceniane jest w skali punktowej 0-3 (z przeskokiem co 0,5), gdzie 0 to brak odpowiedzi, a 3 odpowiedź bezbłędna. Dla oceny pozytywnej z kolokwium wymagane jest uzyskanie >50% maksymalnej liczby punktów.

Ocena niedostateczna z kolokwium skutkuje brakiem zaliczenia.

1. Selekcja roślin transgenicznych - ustalenie stężenia antybiotyku do selekcji regeneratów tytoniu w kulturze in vitro oraz nasion T1 Arabidopsis

2. Uzyskiwanie haploidów u jęczmienia - kultury izolowanych mikrospor.

3. Transformacja genetyczna roślin Arabidopsis

Transformacja z użyciem Agrobacterium metodą in planta (tzw. ‘floral dip’); selekcja transformantów pokolenia T1 i T2; ocena efektywności transformacji; określanie liczby kopii insertu na podstawie segregacji siewek w pokoleniu T2.

4. Rośliny transgeniczne Arabidopsis w genomice funkcjonalnej:

Analiza mutantów insercyjnych:

- identyfikacja homozygot pod względem insertu w badanym genie

- analiza efektu fenotypowego mutacji:

- zdolność do somatycznej embriogenezy mutanta lec2

- odpowiedź na hormony: etylen (analiza „potrójnej odpowiedzi” siewek mutanta erf022) oraz kwas abscysynowy (zdolność do kiełkowania mutanta cbp20 na pożywce z ABA )

5 . Rośliny transgeniczne jako narzędzie genomiki funkcjonalnej (cz. I)

Analiza funkcjonalna genów Arabidopsis:

- identyfikacja linii zawierających konstrukt wywołujący nadekspresję genu ERF022

- identyfikacja linii z nadekspresją genu ERF022

- określenie efektu fenotypowego nadekspresji genu – analiza linii z nadekspresją czynników transkrypcyjnych (LEC2 i ERF022)

- identyfikacja potencjalnych genów targetowych genu LEC2: analiza ekspresji genów syntezy auksyny (YUC10 i YUC1) w siewkach linii z nadekspresją LEC2 i u mutanta lec2

6. Analiza i podsumowanie wyników doświadczeń 1-5.

7. Rośliny transgeniczne jako narzędzie genomiki funkcjonalnej (cz. II)

Rośliny transgeniczne jako narzędzie genomiki funkcjonalnej (cz. II)

Wykorzystanie linii transgenicznych w badaniach rozwoju pędu Arabidopsis thaliana

- linia A. thaliana p35S::GFP-MBD: Różnicowanie komórek epidermy liścia Arabidopsis (dystalno-proksymalne gradienty stopnia falistości i rozmiarów komórek; układ cytoszkieletu tubulinowego w komórkach podstawowych epidermy); Wpływ znakowania cytoszkieletu na fenotyp liści rozetowych

- linia A. thaliana clv3 pCLV3::GFP: badanie wzoru ekspresji transgenu w wierzchołku pędu kwiatostanowego i wnioskowanie na temat roli CLV3 w morfogenezie pędu

8. Transformacja roślin przy użyciu Agrobacterium rhizogenes

- przeprowadzenie poszczególnych etapów prowadzących do otrzymania hodowli stransformowanych korzeni: przygotowanie eksplantantów ze sterylnych roślin (różne gatunki), infekowanie eksplantantów i przekładanie ich na pożywkę MS bez regulatorów wzrostu, odcinanie stransformowanych korzeni i przenoszenie ich na pożywkę z antybiotykiem, przenoszenie stransformowanych korzeni z pożywki bez antybiotyku do pożywki płynnej. Przygotowanie hodowli stransformowanych korzeni.

9. Rośliny transgeniczne jako narzędzie genomiki strukturalnej (cz. I)

Wykorzystanie roślin transformawanych genetycznie w badaniach genomu - metoda FRAP i jej wykorzystanie

- wykonanie komór do przyżyciowej obserwacji jąder w korzeniach siewek Arabidopsis thaliana z wprowadzonym konstruktem 35S:H2A-GFP

- wykonanie eksperymentu FRAP i analiza kinetyki powrotu fluorescencji.

10. Rośliny transgeniczne jako narzędzie genomiki strukturalnej (cz. II)

Analiza transformowanych roślin z wykorzystaniem metod biologii i cytogenetyki molekularnej.

- analiza transgenicznych roślin metodą PCR w celu zidentyfikowania transgenu w genomach wybranych roślin

- lokalizacja wybranych sekwencji w chromosomach wybranych transgenicznych roślin metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH)

- teoretyczna (na podstawie danych literaturowych) analiza wykrywania transgenów w genomach roślinnych na poziomie chromosomów

Ćwiczenia w laboratorium pod nadzorem prowadzącego - wykonywanie doświadczeń w zespołach 2-osobowych na podstawie instrukcji, analiza uzyskanych wyników.